1. تعیین میزان قطر هاله عدم رشد عصاره متانولی خارخسک علیه ایزوله‏های بالینی اشریشیاکلی
2. تعیین میزان غلظتهای مهاری خارخسک روی ایزوله‏های بالینی اشریشیاکلی
3. تعیین میزان MIC90 برای عصاره خارخسک
4. بررسی اثر سینرژیسمی عصاره متانولی خارخسک و جنتامایسین با استفاده از روش دیسک دیفیوژن
5. تعیین اثر سینرژیسمی عصاره متانولی خارخسک و جنتامایسین با استفاده از روش براث دایلوشن (Checkboard microtiter assay)
6. تعیین FIC و FICI برای عصاره خارخسک و جنتامایسین
7. رسم منحنی ایزوبلوگرام عصاره متانولی خارخسک و جنتامایسین
1-3 بیان مسئله
با وجود اکتشافات متعدد پزشکی در زمینه‏های مختلف دارویی و یافتن روش‏های پیشرفته درمانی، آمار نشان دهنده افزایش تعداد بیماری‏های عفونی در کشورهای مختلف می‏باشد.
بیماریهای عفونی از مهمترین بیماریهای شایع در جهان هستند که بار مالی فراوانی را به جوامع بشری تحمیل می‏نمایند. هرچند در دهه‏های گذشته آنتی‏بیوتیک‏های سنتزی توانسته‏اند در درمان بیماریهای عفونی نقش مهمی ایفا نمایند، اما همواره با مشکلات فراوانی همراه شده‏اند (18).
کنترل فساد مواد غذایی و میکروارگانیسم‏های بیماریزا عمدتاً به وسیله عوامل شیمیایی انجام می‏شود (122).بسیاری از این بیماری‏های عفونی بواسطه میکروارگانیسم‏های بیماری‏زا مانند باکتری‏ها، ویروس‏ها، قارچ‌ها و پروتوزا ایجاد می‏شوند و قابلیت انتقال از یک شخص به شخص دیگر را دارا می‏باشند (87). همچنین حضور و رشد میکروارگانیسم‏ها در مواد غذایی ممکن است باعث فساد و در نتیجه کاهش کمیت و کیفیت آن گردد(43). در این میان بخش عمده‏ای از شیوع بیماری و مرگ و میر در انسان‏ها به بیماری‏های ناشی از باکتری‏ها، نسبت داده می‏شود که می‏توانند از طرق مختلف مانند آب آشامیدنی، تنفس و مواد غذایی وارد بدن انسان شوند (25).
یکی از شایعترین باکتری های بیماری‏زا اشریشیاکلی بوده که از طریق آب آلوده و مواد غذایی خام، باعث مسمومیت، اختلالات گوارشی، و در موارد حاد باعث مرگ و میر می‏شود(87). تاکنون بیماری‏های مختلفی ناشی از حضور اشریشیاکلی در آب‏های آشامیدنی و مواد غذایی در نقاط مختلف جهان گزارش شده که می‏توان به رخداد والکرتون در کانادا، هایلند در اسکاتلند و اوساکا در ژاپن اشاره نمود (43).
به علت اثرات جانبی آنتی بیوتیک‏ها و افزایش مقاومت میکروارگانیسم‏ها در برابر آن‏ها، گیاهان دارویی از محبوبیت زیادی در عفونت های باکتریایی برخوردار هستند (65). از دیرباز گیاهان دارویی به واسطه خواص دارویی موجود در ترکیبات آن‏ها، به طور گسترده در طب سنتی و پزشکی نوین استفاده می‏شوند. حدود 80٪ از ساکنان جهان از طب سنتی برای مراقبت های بهداشتی اولیه خود استفاده می‏کنند و گیاهان نقش مهمی درسیستم بهداشت و درمان بازی می‏کنند(21).
درقرن بیست‌و‌یکم که قرن بازگشت به طبیعت و استفاده از گیاهان در درمان نام گرفته است،ما شاهد گسترش روز افزون تحقیقات در زمینه گیاهان دارویی بوده ومشاهده می‌کنیم که روز به روزعرضه داروهای جدید گیاهی ابعاد گسترده‏تری می یابد. کشف دوباره ارتباط بین گیاهان و سلامت، مسئول راه اندازی نسل جدیدی از داروهای گیاهی چند جزیی، مکمل‏های غذایی، مواد غذایی عملکردی و پروتئین های نوترکیب است (7). همچنین ثابت شده است که استفاده از عصاره گیاهان خشک شده به دلیل تجمع مواد موجود در گیاه، موجب تقویت تأثیر درمانی آن و جلوگیری از عوارض جانبی می‏گردد و این عصاره‏ها در فرمهای متنوع دارویــی، قــرص، کپسول، پماد، شربت وغیره که مطلوب بشر قرن بیست‌و‌یکم می‏باشد عرضه می‌شود.
یکی از استراتژی های ممکن در جهت این هدف شـامل شناســایی و بررسی خصوصیات مواد گیاهی فعال زیستی، که فعالیت ضد میکروبی دارند، می باشد(2). با این حال، بیشتر گونه‏های گیاهان در ایران به طور گسترده برای فعالیت‏های ضد باکتری مورد بررسی قرار نگرفته‏اند(10).
کشف دوباره ارتباط بین گیاهان و سلامت، مسئول راه اندازی نسل جدیدی از داروهای گیاهی چند جزیی، مکمل‏های غذایی، مواد غذایی عملکردی و پروتئین‏های نوترکیب است(2). بنابراین جستجو برای عوامل ضد میکروبی جایگزین لازم است. یکی از استراتژی های ممکن در جهت این هدف شـامل شناســایی و بررسی خصوصیات مواد گیاهی فعال زیستی، که فعالیت ضد میکروبی دارند می‏باشد(40).
از این رو محققان، به بررسی ترکیبات فعال استخراج شده از گونه‌های مختلف گیاهی جهت از بین بردن میکروارگانیسم‏های بیماری‏زا علاقمند می‏باشند. متابولیت¬های ثانویه گیاه مانند اسانس¬ها و فلاوونوئید¬ها به علت خواص ضد¬میکروبی، ضدباکتریایی، ضدقارچی و آنتی‌اکسیدانی به طور گسترده مورد استفاده قرار گرفته‏اند (105).
گیاه خارخسک (Tribulus terrestris) متعلق به خانواده Zygophyllaceaeاست و قسمت های مورد استفاده این گیاه میوه، دانه، برگ، ریشه و گاهی تمام قسمت‌های گیاه است ولی اغلب، میوه آن مورد استفاده قرارمی‌گیرد. این گیاه دارویی به عنوان علف هرز در بیشتر مناطق دیده می‌شود. اگرچه گیاه خارخسک در آمریکا و استرالیا گیاهی سمی محسوب می‌شود(17) اما در طب سنتی چین و هند پیشینه‌ای طولانی و مصارف درمانی بسیار دارد (25).
این گیاه با گل‌های زرد رنگ در مناطق صحرایی و با شرایط نامناسب هم رشد می‌کند. خارخسک به عنوان گیاه یک ساله در آب ‌و هوای سرد پرورش می‌یابد. از ترکیب‌های مفید و فعال موجود در گیاه خارخسک می‌توان به ساپونین‌ها، لیگنینامیدها، فلاونوئیدها، آلکالوئیدها وگلیکوزیدها اشاره کرد (105).
مطالعات آزمایشگاهی روی حیوانات حاکی از آن است که مصرف این گیاه به افزایش ترشح هورمون تستوسترون و همچنین افزایش قدرت و حجم عضلات منجر می‌شود. همچنین مصرف این گیاه تولید سلول‌های جنسی مردانه و زنانه را افزایش می‌دهد (39). همچنین گیاه خارخسک در درمان بیماری‌های قلبی عروقی، همچون فشارخون بالا، کم‌خونی و ضعف گردش خون موثر است. این گیاه دارای خواص ضد جهش‏زایی است (58). همچنین خارخسک به عنوان یک ضد باکتریال در بیماری ادراری در طب سنتی استفاده می‏شود (22و23).
مطابق با مصرف سنتی خارخسک در درمان عفونت‏های ادراری و اینکه شایعترین عامل عفونت ادراری باکتری اشریشیاکلی است، این تحقیق طراحی گردید.
هدف از انجام این مطالعه، ارزیابی اثرات متقابل دارویی و فعالیت ضد باکتریایی عصاره متانولی خارخسک روی ایزوله‎های بالینیاشریشیاکلی، به عنوان شایعترین باکتری بیماری‌زای عفونت ادراری می‏باشد.
1-4 فرضیه ها
1. آیا گیاه خارخسک روی اشریشیاکلی اثر ضدباکتریایی دارد؟
2. میانگین قطر هاله عدم رشد برای عصاره خارخسک و جنتامایسین چقدر خواهد بود؟
3. میزان میانگین MIC و MBC برای عصاره خارخسک در مقابل ایزوله‏های بالینی چقدر خواهد بود؟
4. افزودن عصاره خارخسک به محیط کشت میزان قطر هاله عدم رشد دیسک جنتامایسین را چقدر تغییر خواهد داد؟
5. آیا افزودن عصاره خارخسک به محیط کشت میزان MIC جنتامایسین را در مقابل ایزوله استاندارد چقدر تغییر خواهد داد و میزان FIC و FICI چقدر خواهد بود؟
1- 5 باکتری اشریشیاکلی (Escherichia coli)
اشریشیاکلی عضو خانواده انتروباکتریاسه است.اعضای این خانواده در خاک، آب و گیاهان همچنین به عنوان جزئی از فلور نرمال روده بیشتر حیوانات و انسان وجود دارند.این گروه از باکتری‏ها علت 35-30% سپتی‏سمی و بیشتر از 80% عفونت‏های دستگاه ادراری هستند(1).اشریشیاکلی توانایی تولید توکسین‏های متفاوتی را دارد و در ایجاد بیماری‏هایی مثل باکتریمی، عفونت‏های دستگاه ادراری ، گاستروانتریت، مننژیت نوزادی و عفونت‏های داخل شکمی نقش دارد(66). این باکتری‏ها به عنوان نشانگر و شاخص آلودگی مواد غذایی و آب با مدفوع مورد استفاده قرار می‏گیرند (112). مقاومت به چند دارو در اشریشیا کلی و سایر اعضاء انترو باکتریاسه شایع است و تحت کنترل پلاسمیدهای قابل انتقال می‏باشد(98).
1-1-5 خصوصیات مورفولوژی
اشریشیا کلی سلول‏های میله‏ای شکل با 4-2 میکرومتر طول و 5/1-1/1 میکرومتر عرض هستند که انتهای گرد دارند و به صورت منفرد، زنجیره دوتایی و یا چند تایی قرار می‏گیرد. جدار سلولی این باکتری‏ها شامل لیپوپروتئین براون ،فسفولیپید ولیپو پلی ساکارید است که در واقع ساختمان جدار باکتری‏های گرم منفی است(1،11) اسپور تشکیل نمی‏دهند، بعضی نیز زمانی که در محیط واجد قند و در دمای 20- 15 درجه سانتی گراد کشت داده شوند لایه چسبناک در اطراف خود ایجاد می‏کنند. این باکتری دارای فلاژل و پیلی است بنابراین حدود 80% سویه‏های باکتری متحرک‏اند، همچنین برخی از سویه‏ها، کپسول یا میکروکپسول‏های ساخته شده از پلی ساکارید‏های اسیدی تولید می‏کنند. اشریشیاکلی انواع متفاوتی از پیلی را تولید می‏کند که از نظر ساختمانی و خصوصیات آنتی‏ژنی متفاوت هستند و رشته‏های پروتئینی مو شکلی هستند که دور تا دور باکتری را احاطه کرده‏اند. تقریباً 80% سویه‏ها دارای پیلی هستند که اغلب از نوع پیلی تیپ یک است، می‏باشند که توان هم اگلوتیناسیون و اتصال به سلول‏های اپیتلیال را داشته و حساس به مانوز هستند(9).
2-1-5 خصوصیات کشت و بیوشیمیایی
1-2-1-5 خصوصیات کشت
اشریشیاکلی کلنی‏های حلقوی، محدب و مسطح با لبه‏های واضح تشکیل می‏دهند. همچنین اشریشیاکلی به خوبی روی محیط‏های معمولی آزمایشگاهی حاوی منبع کربن و نیتروژن رشد می‏کند. کشت در محیط‏های افتراقی که حاوی رنگ‏ها و کربوهیدرات‏های خاصی هستند،(ائوزین متیلن بلو، مک کانگی یا محیط دزوکسی کولات آگار) تشخیص کلنی‏های تخمیر کننده لاکتوز (رنگی)را از کلنی‏های غیرتخمیر کننده (غیر رنگی) ممکن می‏سازد و تشخیص سریع و احتمالی باکتری‏های روده‏ای را ممکن می کند.این باکتری‏ها هوازی،بی هوازی اختیاری و شیمیوارگانوتروف هستند و در طیف وسیعی از دما رشد کرده اما دمای مناسب برای رشد آنها 37 درجه سانتی گراد می باشد(4).
اشریشیاکلی کلنی‏های مدور، درشت، محدب و بدون پیگمان در سطح نوترینت آگار و بلاد آگار تولید می‏کند و بعضی از سویه‏ها، به ویژه سویه‏های مرتبط با بیماری‏های مجاری ادراری، از طریق ایجاد همولیز در آگار خونی، کلنی‏هایی با جلای فلزی در محیط‏های کشت افتراقی ائوزین متیلن بلو آگارو آزمون ایندول مثبت شناسایی می‏شوند.سویه‏های اشریشیاکلی در غلظت‏های پایین نمک‏های صفراوی 5%(سدیم دی اکسی کولات) باقی می‏مانند و درمحیط مک کانگی، به علت تولید لاکتوز به صورت کلنی‏های صاف، شفاف، براق و صورتی رنگ رشد می‏کنند. اکثر موارد جدا شده متحرکند و پیگمان تولید نمی‏کنند کلنی‏های این باکتری در محیط دزوکسی کولات سیترات آگار ، کوچک، صورتی وکدر است. این باکتری در محیط براث کدورت ایجاد می‏کند(1و11).
2-2-1-5 خصوصیات بیوشیمیایی
از نظر بیوشیمیایی طیف وسیعی از قندها را تخمیر کرده و فاقد آنزیم سیتوکروم اکسیداز بوده و اکسیداز آن منفی است. آنها باکتری‏های کاتالاز مثبت، احیاء کننده نیترات، بی‏هوازی اختیاری و غیر اسپور دار هستند. اشریشیاکلی قادر است از استات به عنوان منبع کربن استفاده کند اما قادر به استفاده از سیترات نیست، لذا از محیط سیمون سیترات برای شناسایی آن استفاده میشود. این باکتری گلوکز و سایر کربوهیدرات را تخمیر کرده و پیرووات تولید می‏کند سپس آن را به اسیدهای لاکتیک، استیک و فرمیک تبدیل می‏کند، قسمتی از اسید فرمیک تولید شده، طی سیستم پیچیده هیدروژن لیاز به مقادیرمساوی از CO2 و H2تبدیل می‏شود(4، 8 و11).
1-6 ساختار آنتی ژنی اشریشیاکلی
انتروباکتریاسه‏ها، ساختار آنتی‏ژنی پیچیده‏ای دارند. آنها به وسیله بیش از 150 نوع آنتی‏ژن مقاوم به حرارت O سوماتیک (مربوط به لیپو پلی ساکارید)،بیش از 100 آنتی ژن حساس به حرارت K(مربوط به کپسول) و بیش از 50 نوع آنتی‏ژن H(مربوط به تاژک) طبقه بندی می‏شوند، طبقه بندی آنتی‏ژنی انتروباکتریاسه‏ها اغلب نشان دهنده وجود هر یک از آنتی‏ژن‏های اختصاصی می‏باشد. بنابراین فرمول آنتی‏ژنی اشریشیاکلی به صورت O55:K5:H21 می‏باشد(11).
1-1-6 آنتی ژن سوماتیک یا آنتی ژن O