بسیاری موارد از این روش برای تشخیص گونه ها با استفاده از مقادیر متغیر فلاوونوییدها در میان آنها استفاده شده است. این روش به ویژه برای شناسایی مشتقات فلاوونوییدها به کار رفته است.
فلاوونویید ها به علت تأثیرات بالقوه مفید آنها بر روی سلامتی انسان همچون ضد ویروسی، ضد آلرژی، ضد التهاب، ضد تومور و فعالیت های آنتی اکسیدانی بسیار مورد علاقه برای مطالعات آزمایشگاهی هستند. آنتی اکسیدان ها ترکیباتی هستند که سلولها را ازاثرات مخرب گونه های اکسیژن واکنشگر (ROS) همچون سوپر اکسید، اکسیژن تک ظرفیتی، رادیکال های پروکسید، رادیکال های هیدروکسیل محافظت می کنند. عدم تعادل بین آنتی اکسیدانها و گونه های اکسیژن واکنشگر منجر به استرس اکسیداتیو و در نهایت آسیب سلولی می شود. فلاوونوییدها یا بیو فلاوونوییدها یک گروه یوبی کوئیتین از ترکیبات پلی فنولی هستند که در بیشتر گیاهان ، دانه ها، پوست میوه ها، پوسته و بشره گیاهان و گل ها وجود دارند. فلاوونوییدها ترکیبات پلی فنولی محلول در آب و شامل 15 اتم کربن می باشند شکل آنها به صورت دو حلقه بنزنی است که با یک زنجیره 3 کربنه کوتاه به هم متصل شده اند. فلاوونوییدها از 6 زیر گروه عمده تشکیل شده اند : کالکون، فلاوون،فلاوونون ،فلاوونول، آنتوسیانون و ایزو فلاوونویید. فلاوونوییدها همراه با کاروتن ها مسوول رنگ میوه ها، گیاهان و سبزیها هستند. (Mukund et al.,2013, Ibañez et al.,2012)
1-8-2-1- بیوسنتز فلاوونوئیدها
بیوسنتز فلاوونوئیدهایی که عمدتا به شکل گلیکوزیدی هستند توسط اسید آمینه فنیل آلانین و در برخی گیاهان اسید آمینه تیروزین توسط آنزیم لیاز تعیین می گردد و آنزیم های آِن مسیر شامل فلاونون سینتاز می باشند که باعث فعال کردن آنزیم مانولیل ترانسفراز می شود. اتصال حلقه آروماتیک (با منشأ استات) با ترکیبات هتروسیکلیک ممکن است نه تنها در دومین اتم کربن (در فلاون)بلکه در سومین (در ایزوفلاون ها) و حتی چهارمین حلقه (در نئوفلاونوئیدها) نیز انجام پذیرد. این عمل با انتقال گروه های فنیل از دومین اتم کربن انجام می پذیرد. احتمال دیگر اکسیداسیون تر کیبات هتروسیکلیک است که می تواند منجر به تشکیل انواع مختلفی از فلاوونوئیدها (نظیر فلاونون، فلاون و فلاونول) گردد.(امید بیگی، 1384) حلقه A از سه مولکول استات از مسیر استات به وجود می آید. حلقه B و پل سه کربنه (حلقه C ) از یک مولکول فنیل پروپان از مسیر شیکمیک اسید به وجود می آید.
1-8-2-2- انواع فلاوونوئیدها
گروه های عمده فلاوونوئیدها شامل:
1-Anthocyanidins and Anthocyanins
بر روی اتم اکسیژن یک بار مثبت دارند. دو پیوند دوگانه در حلقه B دارند. آنتوسیانیدین ها (Aglycones) به قند متصل نیستند. آنتوسیانین ها ((glycoside دارای یک یا چند مولکول قند متصل به گروه هیدروکسیل کربن شماره 3 در حلقه C هستند. قندهای دیگری نیز ممکن است به گروه های هیدرو کسیل دیگر نیز متصل شوند. مانند: CyanidinوCyanin
2- Proanthocyanidins
پلیمر 10-2 مولکول آنتوسیانیدین هستند. مانند Procyanidin C2 و Procyanidin B5
3-Flavonols
گروه های –OH به ساختار پایه متصل هستند . مانند : Epicatechinو Catedhin و Flavan-3-ol
4-Flavonols
شبیه به فلاوانول ها هستند اما یک اتم اکسیژن با پیوند دو گانه به کربن 4 حلقه C متصل است. مانند Quercetin
5-Flavones
شبیه به فلاوننول هستند اما گروه-OH متصل به کربن3 حلقه C را ندارند. مانند Apigenin و Luteolin
6-Flavonone
شبیه به فلاون هستند اما پیوند دو گانه بین کربن های 2و 3در حلقه C را ندارند. مانند:Naringenin
7-Isoflavones
ایزومر فلاون ها هستند اما حلقه B به جای اتصال به کربن 2 حلقه C ، به کربن 3 متصل است. مانند:Daidzein و Genistein(پاکزاد،1386)
1-9- لیپیدها
منابع دریایی به طور گسترده ای برای داشتن ترکیبات چربی ویژه مورد توجه قرار گرفته اند، که این امر آنها را به عنوان یک منبع جالب توجه برای استخراج چربی در نظر گرفته است. چربی های اصلی قطبی موجود در این موجودات شامل دی اسیل گلیسرول مونو گالاکتوزیل ،دی گالاکتوزیل دی اسیل گلیسرول و فسفاتیدیل گلیسرول است. این چربی های قطبی دارای چندین فعالیت عملکردی هستند، اما به طور عمده در منابع برای فعالیت های ضد التهابی خود شناخته شده اند. استخراج اسیدهای چرب غیر اشباع چند گانه که به میزان زیادی برای سلامتی انسان مفید هستند در جلبک ها مورد بررسی قرار گرفته است. دیگر ترکیبات فعال زیستی به دست آمده از منابع دریایی استرول ها هستند. ترکیب استرول های جدا شده از جلبک ها و ریز جلبک ها به میزان زیادی مورد مطالعه قرار گرفته است. استرول ها و برخی مشتقات آنها نقش مهمی در کاهش سطح کلسترولLDL خون بازی می کنند. سایر فعالیت های زیستی مرتبط به استرول ها شامل فعالیت های ضد توموری و ضد التهابی می باشد. به علاوه فیتو استرول ها پیش ساز مهم برخی ویتامین ها هستند. برای مثال ارگواسترول پیش ساز ویتامین D2 و کورتیزون است.kanda and Lee., 2011) وIbañez et al.,2012).
1-10- کربوهیدرات ها
جلبک ها به عنوان منبع غنی پلی ساکاریدهای سولفاته در نظر گرفته شده اند. انواع مختلف کربو هیدرات ها شاملagar carrageenan, یا alginatesاز جلبک ها استخراج شده اند و این کربو هیدرات ها به طور گسترده ای در صنعت غذایی و دارو سازی به عنوان ترکیبات عملکردی به صورت تثبیت کننده ها کاربرد دارند. برای مثال جلبک Chondrus crispus به طور سنتی برای استخراج carrageenan , یک پلی ساکارید فوق سولفاته به کار رفته است و همچنین منبع غنی از فرآورده های پروبیوتیک و فیبر موجود در رژیم غذایی را تشکیل می دهند. در بین سایر خواص زیستی مرتبط به آنها خواصی همچون تعدیل کننده ایمنی، ضد سرطان، ضد التهاب، ضد ویروس یا سایر فعالیت های آنتی اکسیدانی اشاره شده است. به طور کلی این پلی ساکارید ها می توانند ترکیب خود و بنابراین خواص مربوط به خود را تغییر دهند. برای مثال فعالیت زیستی می تواند بسته به درجه سولفاته شدن ، وزن مولکولی ، قند غالب و یا استخلاف گلیکوزیدی متفاوت باشد. Qi et al. 2005,2011, Li et al,2008).)
1-11- پپتیدها و پروتیین ها
در حال حاضر پروتیین هایی با منشأ دریایی به واسطه ترکیبات فعال زیستی بالقوه آنها و ویژگی های عملکردیشان به میزان زیادی مورد توجه قرار گرفته اند. فیکوبیلی پروتیین ها یکی از مهمترین گروه های پروتیینی با منشأ دریایی هستند. این پروتیین های قابل حل در آب عمدتأ در جلبک های سبز-آبی و قرمز یافت می شود. این پروتیین دارای خواص عملکردی ضد التهابی، محافظت کبدی و فعالیت آنتی اکسیدانی است. در واقع استخراج این پروتیین ها از جلبک های مختلف با در نظر گرفتن اهمیت اقتصادی آنها به میزان زیادی مورد مطالعه قرار گرفته است. روش استخراج فاکتوری کلیدی در افزایش بازیابی و احیا این پروتیین به شمار می رود. دستورالعمل استخراج به طور معمول شامل انتخاب منبع مناسب است که با متلاشی کردن سلول های جلبک و آزاد سازی پروتیین ها دنبال می شود. اما در این رابطه احتمال دستیابی به پپتید های فعال زیستی هم وجود دارد که این پپتیدها دارای خواصی همچون اثرات ضد التهابی، ضد فشار خون بالا، ضد لخته شدن خون و فعالیت های ضد میکروبی هستندRomay et al. 2003 ; Bhat and Madyastha 2000 ) ).

فصل دوم
مواد و روش ها

نمونه برداری با استفاده از ظرف های شیشه ای اتوکلاو شده در شرایط کاملا استریل از مناطق مختلفی همچون عباس آباد شازند، خنداب، پارک های ملایر، سراب گیان نهاوند و میدان شریعتی شهر اراک در تاریخ های مختلف و با فواصل منظم درمقطع زمانی بهار انجام شد و سپس نمونه ها پس از ثبت مندرجات مشخصات تا زمان آزمون جهت انجام خالص سازی با استفاده از واکشت های مختلف به آزمایشگاه منتقل و در فریزر نگهداری شد. نمونه ها بر روی 4 صافی میلی پوری 45/0 میکرومتری استریل فیلتر شدند و در دو محیط کشت مناسب Chu و BG-11 در شرایط نوری مناسب با شدت نور 3500 لوکس نوری ، درجه حرارت 25 درجه سانتی گراد و دوره متناوب نوردهی شامل 14 ساعت روشنایی و 10 ساعت تاریکی کشت داده شدند. میزان شدت نور توسط لامپ های سفید 40 واتی فلورسنت در فاصله 40 سانتی متری از سطح تعیین شد. شناسایی گونه های حاصل بر طبق کلید شناسایی معتبر پرسکات (Prescott,1962)انجام شد.
در این بررسی از محیط کشت جامد و مایع BG-11 و Chu برای رشد جلبک Chlorella vulgarisاستفاده شد.
وسایل:
ترازوی دیجیتالی(Elester)
پارافیلم(ORIGIN USA)
استوانه مدرج(GLASSCO)
بالن 1000(ISOLAB GERMAVY)
هود(NOORSANAT.CO)
پیپت(HBG GERMANY)
شیشه های نشکن مخصوص اتوکلاو(ISOLAB GERMAVY)
لام و لامل(PEARL BRAND)
میکروسکوپ(CARLZEISS)
اتوکلاو(شرکت ایران تولید)

میزان بر حسب میلی گرم بر لیتر ماده
400 KNo3 مرک
80 K2HPO4 مرک
107 Ca.Cl2.2H2O مرک
200 MgSO4.7H2O مرک
20 Ferric citrate مرک
100 Ferric acide مرک
0.02 CoCl2 مرک
5.72 H3BO3 مرک
3.62 MnCl2.4H2O مرک
0.44 ZnSO4.H2O مرک
0.16 CuSO4.5H2O مرک
0.084 Ma2.NO4 مرک
0.072 NH4.SO4 مرک
جدول2-1- مواد تشکیل دهنده محیط کشت Chu
2-1- تهیه محیط کشت Chu
مواد فوق را وزن کرده در یک بالن 1000 سی سی ریخته و سپس با آب مقطر به حجم رسانده برای تهیه محیط کشت جامد از 5/7گرم آگار استفاده کرده این محیط کشت ساخته شده را در اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه قرار داده و بعد از سرد شدن برای کشت جلبک استفاده کرده محیط کشت جامد را در داخل پیپت ریخته و بعد از اینکه مانند ژله خود را گرفت مورد استفاده قرار داده . برای کشت جلبک در محیط کشت حاوی آگار از لوپ استفاده کرده.
2-2-آماده کردن محیط کشت BG-11
وسایل:
ترازوی دیجیتالی(Elester)
پارافیلم(ORIGIN USA)
استوانه مدرج(GLASSCO)
بالن 1000(ISOLAB GERMAVY)
هود(NOORSANAT.CO)
پیپت(HBG GERMANY)
شیشه های نشکن مخصوص اتوکلاو(ISOLAB GERMAVY)
لام و لامل(PEARL BRAND)
میکروسکوپ(CARLZEISS)
اتوکلاو(شرکت ایران تولید)
ماده مورد نیاز برای 1000 لیتر برای 100 لیتر
NaNo3(مرک) 15گرم 1.5 گرم
K2HPO4(مرک) 2 گرم 0.4گرم
،MgSO4.7H2O(مرک) 3.75 گرم 0.75 گرم
،CaCl2.2H2O(مرک) 1.80 گرم 0.36 گرم
Ammonium ferric citrate green(مرک) 0.30 گرم 0.06 گرم
Citric acid(مرک) 0.30 گرم 0.06 گرم
Na2CO3(مرک) 1 گرم 0.5 گرم
EDTA Na2(مرک) 0.05 گرم 0.01 گرم

این محیط که از رایج ترین محیط های مورد استفاده برای سیانوباکتریها است در هر لیتر حاوی مواد زیر است)زرینی و همکاران 1390):
جدول2-1- مواد موردنیاز تهیه محیط کشت BG-11
metal solution Trace که حاوی مواد زیر است:
3H3BO 2.86 0.286
MnCl2.4H2O 1.81 0.181
ZnSO4.7H2O 0.22 0.02
NaMoO4.2H2O 0.39 0.039
CuSO4.5H2O 0.08 0.008
CO(NO3)2.6H2O 0.05 0.005

برای تهیه استوک مورد نیاز محیط کشت BG11 هر یک از مواد بالا را وزن کرده در بالن 100 میلی لیتری با آب مقطر به حجم رسانده.
روش تهیه محیط کشت مذکور به این صورت می باشد که درابتدا برای ساخت 1000 میلی لیتر محیط کشت 11-BG ، 1.5 گرم NaNo3 را با 100 میلی لیتر آب مقطر به حجم رسانده سپس به بالن 1000 میلی لیتری اضافه کرده و با استفاده از پیپت 10 میلی لیتر از استوک K2HPO4 برداشته و به مواد اولیه اضافه کرده سپس 10 میلی لیتر از استوک مواد(MgSO4.7H2O،CaCl2.2H2O) فریک آمونیوم سیترات، سیتریک اسید، Na2CO3، EDTA Na2) را برداشته و به بالن 1000 میلی لیتری اضافه کرده اما با استفاده از پیپت 1 میلی لیتری از استوک حاوی (MnCl2.4H2O ،3H3BO، ZnSO4.7H2O، NaMoO4.2H2O، CuSO4.5H2O، CO(NO3)2.6H2O)به طور جداگانه 1 میلی لیتر برداشته و به بالن 1000 میلی لیتری اضافه کرده و سپس این استوک ها را با استفاده از آب مقطر به حجم 1000 میلی لیتر رسانده این استوک های به حجم رسیده محیط کشت غیر استریل هستند و برای استریل شدن به دستگاه اتو کلاو