ریزجلبکی به صورت کشت مایع و جامد، سویه های مورد نیاز را در اختیار محققین قرارمی دهد. در ایران هم پارک علم و فن آوری خلیج فارس اقدام به جمع آوری و کشت سویه های مختلف جلبکی کرده و به مطالعه محققین می تواند سودمند باشدPrescott et al1992,Kuzmina,2004).)
1-6-2-غربالگری
هرگاه یافتن نوع به خصوصی از ریزجلبکها با خصوصیاتی ویژه از خاستگاه و محیط های طبیعی آنها موردنظرباشد باید به روشهای غربالگری متوسل شویم. به عنوان مثال اگر هدف، پیداکردن سویه ریزجلبکی موثر بر آلاینده های محیط زیست باشد یکی از روشهای توصیه شده آن است که در محل آلودگی با آلاینده به جستجوی ریزجلبکهای مقاوم یا تجزیه کننده آن بپردازیم. مرحله پس از یافتن سویه، خالص سازی، شناسایی و کشت بهینه آن در محیط آزمایشگاهی خواهد بود. بررسی چگونگی و میزان حذف آلاینده های طبیعی توسط سویه غربال شده در مرحله بعدی قراردارد. غربالگری به طور عمده در چند مرحله انجام می گیرد که در ادامه بحث می شود(2008.( Jhon DM et al, 2002, Shokravi
1-6-2-1-غربالگری از خاستگاههای طبیعی
گام اول در جداسازی یک ریزجلبک از خاستگاه طبیعی آن، انتخاب نوع محیط زیست ریزجلبک با شرایطی ویژه بر اساس اهداف نهایی تحقیق است. به عبارت دیگر، جستجو در زیستگاههای مناسب به منظور افزایش احتمال یافتن نوع خاصی از ریزجلبک، مراحل بعدی بخصوص مرحله خالص سازی یک سویه با ویژگی های مطلوب را آسانتر می سازد. به طور عمده، نمونه های خاک و آب ممکن است از مناطق مختلفی مانند چشمه های آب گرم، یخهای قطبی، فاضلابهای صنعتی، شالیزارها و بسیاری از زیستگاههای دیگر جمع آوری شوند. بنابراین با توجه به هدفی که در نظرگرفته می شود، زیستگاه مناسب جهت جداسازی ریزجلبکها انتخاب می گردد. مثلاً اگر هدف جداسازی یک گونه سرمادوست باشد می توان نمونه را از زیستگاههایی نزدیک مناطق سردسیر تهیه کرد. در مواردی نمونه های حاوی ریزجلبکها جمع آوری شده باید فیلترشوند و در مواردی نیز نمونه مستقیماً و بدون نیاز به انجام مرحله اضافی جهت جداسازی و غربالگری، مورد استفاده قرارمی گیرند. در مواردی که گونه های ریزجلبکی به صخره ها و پوسته صدف ها چسبیده اند باید با تراشیدن، آنها را از سطوح جدا نمود Shokravi ,et al,2007, Bellinger, et al 1992 )).(اسماعیلی ساری و همکاران، 1379).
1-6-3- غنی سازی محیط کشت
در این روش، شرایط مناسب جهت رشد و تکثیر یک گروه خاص مثلاً ریزجلبکهای فتوسنتزکننده فراهم می شود؛ درحالیکه در آن شرایط سایر ریزجلبکها رشدنمی کنند. مثلاً برای جداکردن یک ریزجلبک فتوسنتزکننده از خاک ابتداء 5 تا 10 میلی گرم از نمونه خاک را به 5/2 تا 3 میلی لیتر از محیط کشت مناسب جهت رشد ریزجلبکها اضافه می کنیم و به مدت 3 هفته آنها را در پلیت های میکروبیولوژی، در دمای25 درجه سانتیگراد نگهداری می کنیم. در صورت نوردهی مناسب به همراه دمیدن هوای حاوی 5 درصد دی اکسیدکربن، پس از طی مدت زمانی، آثار رشد ریزجلبکهای موجود قابل مشاهده خواهد بود. سلولهای رشدیافته در پلیت های اولیه را در مرحله بعد به پلیت های جدیدی منتقل می کنیم تا ریزجلبک هدف جداسازی گردد. محیط کشت حاوی املاح و آگار برای جداسازی انواع فتوسنتزکننده و محیط کشت حاوی یک ترکیب آلی کربندار برای رشد انواع میکسوتروف قابل استفاده خواهد بود. به دنبال چند مرحله تکرار روند مذکور و تعویض محیط کشت، در نهایت به جداسازی و خالص سازی یک سویه مشخص از ریزجلبکها خواهیم رسید. در مواردی که نمونه های آب حاوی ریزجلبکها مورد نظر باشد یک تیمار اولیه ضروری است. در این حالت، با عبوردادن نمونه ازصافی مناسب و به دنبال آن شستشوی توده سلولی پشت صافی با آب مقطر استریل، باقیمانده به محیط حاوی آگار اضافه می شود. پس از2 الی3 هفته انکوباسیون در شرایط نوری و دمایی مناسب، کلنی های پدیدارشده به صورت استریل به محیط مایع و استریل منتقل می گردند تا توده زیستی کافی ایجاد گردد. . (Bellinger, et al,1992)
1-6-4- جداسازی مستقیم
در این روش به کمک میکروپیپت یا فیلدوپلاتین سلولهای تکی و یا رشته های تشکیل شده ازریزجلبک هدف از خاستگاه طبیعی آن برداشت شده و بر سطح یک پلیت آگاردار انتقال می یابد. در یک روش مشابه، به کمک نوعی دستگاه اسپری کننده، نمونه برداشته شده از منبع اولیه به صورت قطرات بسیار ریز روی سطح پلیت اسپری می گردد. پس از انکوباسیون، تک کلونیهای پدیدآمده از سطح آگار برداشته شده و به محیط کشت مایع منتقل می گردند. (Bellinger, et al,1992)
1-6-5- تولید کشت خالص
مرحله اصلی و مهم در غربالگری ایجاد یک کشت خالص است. به عبارت دیگر در این مرحله تلاش می شود نمونه مشخصی از ریزجلبک که فاقد هر نوع ارگانیسم دیگری از جمله باکتری، قارچ، پروتوزوا و غیره باشد، موردکشت قرارگیرد. از جمله روشهایی که به این منظور استفاده می شود می توان به موارد زیر اشاره کرد.
استفاده از جهت تابش نور: ریزجلبکها به دلیل تمایل بالایی که به نور دارند در معرض نور مناسب تجمع می یابند. البته ذکراین نکته نیز ضروری است که شدت بالای نور امکان ایجادآثار معکوسی نظیر دوری گزینی ریزجلبکها از نور را سبب می شود که در این صورت رشدی مشاهده نمی گردد. در صورت استفاده از روش تیمار نوری، در ظروفی کاملاً پوشیده و تاریک،منفذی باریک جهت تابش نور ایجادمی کنیم. در این صورت فقط دستهای از ریزجلبکها خصوصاً انواع تاژکدار به سمت منفذ نورانی حرکت می کنند و در حوالی آن تجمع مییابند که می توان آنها را به کمک یک پیپت از مناطق مذکور جمع آوری نمود. به دلیل افزایش تراکم سلولهای فتوسنتزکننده در آن مناطق، مراحل بعدی خالص سازی راحت تر و سریعترانجام خواهدشد . (Bellinger, et al,1992 )
1-6-5-1- شستشوی سلول: یکی از علل آلودگی، چسبیدن و اتصال سلولهای دیگر به ریزجلبک مورد نظراست. در این روش، پس از برداشت سلولهای ریزجلبک اولیه به کمک یک میکروپیپت آن را چندین بار به محیطهای مایع و استریل وارد میکنند. تکرار این عمل به محیط کشت تازه و کشیدن مجدد آن می تواند سایر میکروارگانیسمهای آلوده کننده را حذف کند. (Bellinger, et al, 1992)
1-6-5-2- رقیق سازی سریالی : این روش که بطور معمول جهت خالص سازی باکتریها بکارمی رود،براساس شانس و احتمال حضور یک میکروارگانیسم خاص در رقت های بسیار پایین پایه گذاری شده است. برای انجام آن، ابتدا محیط های مایع و استریلی که مخصوص رشد ریزجلبک هدف است فراهم می گردد. نمونه مورد نظر پس از طی مراحل اولیه آماده می شود و به اولین لوله حاوی محیط کشت مایع انتقال می یابد. حجم معینی (مثلاً 2 میلیلیتر) از لوله اول حاوی میکروارگانیسم به لوله بعدی افزوده می شود. پس از همزدن و مخلوط کردن، مجدداً همان حجم معین از لوله دوم به لوله سوم منتقل می گردد تا به آخرین لوله که بالاترین رقت از ارگانیسم هدف فراهم شده باشد این عمل تکرارمی شود. مقادیر مشخصی از مایع درون لوله ها به پلیتهای حاوی آگار و محیط کشت اختصاصی ریزجلبک منتقل می شود و فرصت و شرایط لازم جهت رشد آنها فراهم می گردد. در این صورت احتمال حضور میکروارگانیسم آلوده کننده کمتر خواهدبود. این عمل احتمال خلوص ریزجلبک منتخب را افزایش می دهد. . (Bellinger, et al ,1992)
1-6-5-3- سانتریفوژ شیب چگالی : در صورت ایجاد یک محدوده شیب چگالی به کمک ترکیباتی ویژه و با استفاده از یک سانتریفوژ، امکان جداسازی ریزجلبکها از نمونه وجود دارد. از آنجا که چگالی مربوط به سلولهای ریزجلبکی در مقایسه با باکتریها متفاوت است با استفاده از این تکنیک می توان ریزجلبکها را از باکتریها جدا نمود. در یکی از این روشها از ترکیب سیلیکاسل پرکول به جهت ایجاد شیب چگالی و متعاقب آن، جداسازی ریزجلبکها استفاده می شود.
1-6-5-4- تابش نور ماوراء بنفش: اغلب جلبکها در مقایسه با باکتریها مقاومت بیشتری در برابر تابش نورUV از خود نشان می دهند. بنابراین به دنبال تاباندن اشعه UVسپس شستشو، رقیق سازی نمونه و اسپری کردن بر سطح یک محیط انتخابی حاوی آگار احتمال بدست آوردن یک کشت خالص از ریزجلبک بالا می رود (. (Kuzmina, et al, 2004
1-6-5-5- صاف کردن: جلبکهای بزرگ و ریزجلبکهای رشته ای را می توان به کمک یک فیلتراسیون ساده از باکتریها جداسازی نمود. رشته های جداشده را می توان با استفاده از دستگاه سونیکاتور به رشته هایی با طول کمتر (3 تا 5سلول) تبدیل نمود و سپس نمونه های رقیق شده در پشت فیلتر را به محیط کشت مناسب منتقل کرد(. (Kuzmina, et al, 2004
1-6-5-6- استفاده از آنتی بیوتیکها: چندین نوع آنتی بیوتیک به طور مؤثر در حذف آلودگی باکتریایی از جلبکها مورد استفاده قرارگرفته اند. مثلاً محیط آگاردار حاوی ایمیپنم به میزان( 100 میکروگرم در میلی لیتر) جهت خالص سازی ریزجلبکهای یوکاریوتی و همچنین تک سلولی بکارمی رود.( نیستا نین به میزان 100 میکروگرم در میلی لیتر) و نیز سیکلوهگزیمید برای حذف آلودگیهای قارچی و خالص سازی انواع سیانوباکتریها بکارمی رود . (Kuzmina, et al, 2004)
1-6-6- شناسایی ریزجلبکهای جداشده
مرحله پس از غربالگری اولیه، جداسازی و خالص سازی ریزجلبکها از نمونه های محیطی، شناسایی آنها است. شناسایی اولیه شامل تهیه اسلاید و مشاهده میکروسکوپی می باشد. پس از تهیه اسلایدها مانند آنچه که در روشهای میکروبیولوژی انجام می گیرد از اضافه کردن گلیسیرین هنگام قراردادن لامل روی لام و روش مشاهده مستقیم نمونه توسط میکروسکوپ استفاده می شود. برای مشاهده غلاف اطراف سلولها می توان از روش رنگ آمیزی لوگل استفاده کرد. در صورتی که برای مشاهده میکروسکوپی ریزجلبکها لازم باشد از حرکت سریع آنها جلوگیری کنیم، میتوان از فرمالین 4 درصد یا محلول )فرمالین، اسیداستیک، الکل (جهت تثبیت یا بی تحرک سازی استفاده نمود. در مرحله مقدماتی شناسایی ریزجلبکها از ویژگیهای مورفولوژی یا ظاهری آنها استفاده می شود. منابع معتبر متعددی جهت بررسی کلیدهای شناسایی جلبکها وجود دارند که از میان آنها می توان به کتب بلینگر 2 اشاره کرد ( Bellinger, et al 1992).
1-6-6-1- شناسایی ریزجلبکها به کمک آنالیز مولکولی 18S rDNA
از آنجا که به دلیل تنوع بسیار زیاد گونه های ریزجلبکی ممکن است روشهای معمول مانند مشاهده میکروسکوپی و مطالعات مورفولوژی در شناسایی آنها کافی نباشد و از طرفی با توجه به پیشرفت روزافزون روشهای بیولوژی مولکولی و سرعت بالا و همچنین اطمینان و راحتی شناسایی آنها از طریق مقایسه ژنهای محافظت شده 3 در سطح جنس و گونه ریزجلبکها، رویکرد استفاده از آنالیزمولکولی 18S rDNA روشی مناسب خواهد بود. در دهه های اخیر روشهای آنالیز مولکولی در شناسایی میکروارگانیسمهای مختلف بر اساس بررسی توالی ژن کدکننده زیرواحدهای سازنده RNA های ریبوزومی گسترش قابل توجهی یافته است. ناحیه کدکننده ژن16 S rDNA باکتریها به شدت حفاظت شده است و می توان توالی ژن کدکننده این بخش از ژنوم باکتری را پس از تکثیر به کمک تکنیک PCR توالی یابی کرد . با واردکردن این توالی در بانکهای جهانی ژن میتوان ارگانیسم دارای آن توالی را شناسایی نمود. اخیراً همین روش در خصوص ریز جلبکهای یوکاریوتی با یافتن پرایمرهای مناسب جهت تکثیر ژن کدکننده18srDNA توسعه یافته است. برای این منظور ابتدا باید DNA ریزجلبک را استخراج نمود، ناحیه کدکننده ژن18SrDNA را با استفاده ازPCR تکثیرکرد و سپس توالی ژن را تعیین نمود.در مرحله نهایی با مقایسه این توالی در بانکهای جهانی ژنی، ریزجلبک مورد نظر با احتما ل بالایی شناسایی می شود. (Berad , et al,2005, Simon,etal,2000)
1-6-6-2- انجام عملیات BLAST جهت شناسایی سویه ریزجلبک
به منظور مقایسه میزان شباهت توالی ژن srDNA 18 حاصل از مراحل قبل با توالی ژن های موجود در بانک های جهانی ژن و شناسایی ارگانیسم مورد آزمایش عملیات BLAST انجام می گیرد. یکی از معتبرترین آنهاNCBI است به این منظور، با مراجعه به آدرس http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ وارد سایت شده و گزینه BLAST انتخاب می شود. با انتخاب گزینه Nucleotide BLAST و سپس